ỨNG DỤNG KHÓA PHÂN LOẠI HÌNH THÁI VÀ VÙNG 16S rRNA TRÊN DNA TY THỂ TRONG ĐỊNH DANH CÁ BỘT THUỘC HỌ Pangasiidae

LINK DOWNLOAD MIỄN PHÍ TÀI LIỆU "ỨNG DỤNG KHÓA PHÂN LOẠI HÌNH THÁI VÀ VÙNG 16S rRNA TRÊN DNA TY THỂ TRONG ĐỊNH DANH CÁ BỘT THUỘC HỌ Pangasiidae": http://123doc.vn/document/554292-ung-dung-kho-a-phan-loai-hinh-thai-va-vung-16s-rrna-tren-dna-ty-the-trong-dinh-danh-ca-bot-thuoc-ho-pangasiidae.htm

v

TM TẮT

Khóa phân loại hình thái đóng một vai trò quan trọng trong việc định danh cá
bột và cá con thuộc họ Pangasiidae vốn có ý nghĩa về kinh tế đối với vùng Đồng Bằng
Sông Cửu Long. Tuy nhiên, phƣơng pháp này cho độ chính xác nhất định. Vì vậy
chúng tôi phân tích sự khác nhau ở mức độ di truyền cụ thể là vùng 16S rRNA (xấp xỉ
568 bp) trên DNA ty thể (mt DNA) ở 3 loài (đã có sẵn dữ liệu trên ngân hàng gene) để
hỗ trợ phƣơng pháp định danh hình thái.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện phân loại bằng hình thái 976 mẫu cá
thu từ tháng 6/2006 đến tháng 9/2006 trên hai nhánh sông Tiền và sông Hậu. Kết quả
họ Pangasiidae chiếm 36,56% so với tổng mẫu thu đƣợc năm 2006; 3 loài phân tích (P.
hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema) chiếm 33,63% so với tổng mẫu
Pangasiidae thu đƣợc nhƣng số lƣợng chỉ chiếm 11,36% so với tổng lƣợng cá thể họ
Pangasidae.
Các mẫu cá năm 2006 sau khi khi phân tích hình thái không phân tích đƣợc
DNA (do DNA bị hủy trong formal), 26 cá thể từ 64 mẫu cá bột thu từ 22/6/2007 đến
tháng 30/6/2007 đƣợc bổ sung của 3 loài nêu trên với kích thƣớc khác nhau (từ 15 mm
– 30 mm), giải trình tự và đối chiếu với các trình tự chuẩn trên ngân hàng genbank để
kiểm tra lại độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích hình thái. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau:
 Trình tự 8/9 mẫu loài P. hypophthalmus tƣơng đồng 100% với trình tự 3
kiểu gen P. hypophthalmus trên ngân hàng gene (DQ334282, DQ334285, DQ334287).
Riêng mẫu H1 có một đột biến thay thế nucleotide ở vị trí thứ 26 so với tám kiểu gene
tham khảo trên ngân hàng gene.
 Trình tự 9 mẫu phân tích loài P. macronema giống từ 99% - 100% trình tự
P. macronema trên ngân hàng gene (DQ334314).
 Trình tự 8 mẫu loài P. larnaudii tƣơng đồng 100% với trình tự 3 kiểu gen P.
larnaudii trên ngân hàng gene (DQ334303, DQ334312; DQ334313).
Tóm lại, qua kết quả so sánh trình tự của 26 mẫu thuộc 3 loài phân tích với trình
tự dữ liệu chuẩn trên ngân hàng gene đã khẳng định đƣợc khoá phân loại hình thái đối
với các loài mà chúng tôi đƣa ra là phù hợp.




vi


MỤC LỤC

ĐỀ MỤC TRANG
Lời cảm tạ III
Abstract IV
Tóm tắt V
Mục lục VI
Danh sách các chữ viết tắt IX
Danh sách các hình X
Danh sách các bảng và biểu đồ XI
Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 2
1.3. Nội dung đề tài 2
Chƣơng 2. TỔNG QUAN 3
2.1. Tình hình nghiên cứu định danh các loài cá 3
2.1.1. Nghiên cứu thế giới 3
2.1.2. Nghiên cứu trong nƣớc 4
2.2. Phƣơng pháp định danh hình thái định loại một số loài cá bột và cá con thuộc
họ Pangasiidae 5
2.3. Phƣơng pháp sinh học phân tử ứng dụng định loại một số loài cá 8
2.3.1. Phƣơng pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 8
2.3.2. Phƣơng pháp RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 8
2.3.3. Phƣơng pháp AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 8
2.3.4. Phân tích DNA ty thể (mtDNA) 9




vii

2.3.5. Phƣơng pháp PCR 11
2.3.6. Phƣơng pháp giải trình tự bằng hệ thống sắc ký tự động 12
Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 13
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 13
3.2. Vật liệu 13
3.2.1. Mẫu cá 13
3.2.2. Hóa chất 13
3.2.4. Thiết bị và dụng cụ 14
3.3. Phƣơng pháp 15
3.3.1. Phƣơng pháp thu và định danh hình thái mẫu cá bột 15
3.3.2. Phƣơng pháp tách chiết mtDNA bằng phenol-chloroform 16
3.3.3. Phƣơng pháp PCR khuếch đại vùng 16S trên mtDNA 16
3.3.4. Phƣơng pháp điện di acid nucleotide trên gel agarose 17
3.3.5. Phƣơng pháp giải trình tự 18
3.3.6. Phƣơng pháp so sánh các trình tự 18
3.4. Bố trí thí nghiệm 18
3.4.1. Định danh phân loại bằng hình thái các loài cá bột thuộc họ Pangasiidae
18
3.4.1.1. Giai đoạn định tính 18
3.4.1.2. Giai đoạn định lƣợng 20
3.4.2. Ghi nhận các điểm đặc trƣng của cá bột trƣớc khi phân tích DNA 21
3.4.3. Xác định và phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA 22
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23
4.1. Kết quả định danh phân loại bằng hình thái các loài cá bột thuộc họ
Pangasiidae 23
4.1.1. Kết quả hình thái phân loại 23
4.1.2. Kết quả giai đoạn định tính 25




viii

4.1.2.1. Phân tích mẫu xuất hiện họ Pangasiidae so với tổng mẫu thu đƣợc
năm 2006 25
4.1.2.2. Phân tích mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với tổng mẫu
Pangasiidae 27
4.1.3. Kết quả giai đoạn định lƣợng 29
4.1.3.1. Tỉ lệ số lƣợng cá thể của 3 loài cá phân tích và các loài khác 29
4.1.2.4. Tỉ lệ số lƣợng cá thể của mỗi loài cá phân tích so với tổng lƣợng cá
thể họ Pangasiidae 31
4.2. Ghi nhận các điểm đặc trƣng của cá bột trƣớc khi phân tích DNA 33
4.3. Xác định và phân tích vùng 16S rRNA trên mtDNA 34
4.3.1. Nhân dòng vùng gen mã hóa 16S rRNA 34
4.3.2. Phân tích trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của các mẫu cá 38
4.3.2.1. Định danh 9 mẫu thuộc loài P. macronema 38
4.3.2.2. Định danh 9 mẫu thuộc loài P. hypophthalmus 40
4.3.2.3. Định danh 8 mẫu thuộc loài P. larnaudii. 42
Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44
5.1. Kết luận 44
5.2. Tồn tại 45
5.3. Đề xuất 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO 46
PHỤ LỤC 50





ix

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT


bp Cặp bazơ
DNA Deoxyribonucleic acid
mtDNA Mitochondrial DNA
rRNA Ribosomal Ribonucleotide acid
S Svedberg – đơn vị đo lƣờng vận tốc lắng
PCR Polymerase chain reaction
RFLP Restriction Fragment Length Lolymorphism
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
Taq Thermus aquaticus
UI Unit
UV Ultra violet
P. hypophthalmus Pangasianodon hypophthalmus
P. larnaudii Pangasius larnaudii
P. macronema Pangasius macronema
ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long
Ctv Cộng tác viên




x

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2.1. Pangasianodon hypophthalmus Sauvage (1878), 15 mm 6
Hình 2.2. Pangasius larnaudii Bocourt, 1866. 16 mm. 6
Hình 2.3. Pangasius macronema Bleeker, 1851. 15 mm. 7
Hình 2.4: H.2.5a. Cấu tạo tổng quát của ty thể. 9
Hình 2.5. Các picks màu quan sát trên máy Scan 12
Hình 4.1. Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878), 17 mm 33
Hình 4.2. Pangasius larnaudii Bocourt, 1866. 20 mm 34
Hình 4.3. Pangasius macronema Bleeker, 1851. 15 mm 34
Hình 4.4. Sản phẩm PCR khuếch đại vùng 16S rRNA trên mtDNA từ một số mẫu
năm 2006 và năm 2005 35
Hình 4.5: Sản phẩm PCR khuếch đại vùng 16S rRNA trên mtDNA từ vài mẫu cá
đại diện 38
Hình 4.6: Các điểm khác nhau về trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 9 mẫu
cá P. macronema 39
Hình 4.7: Sự tƣơng đồng trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 9 mẫu cá P.
hypophthalmus 41
Hình 4.8: Sự tƣơng đồng trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 8 mẫu cá P.
larnaudii 43






xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ

BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ TRANG
Bảng 2.1. Số lƣợng các tia vi của P. macronema và P. siamensis (nguồn: Apichart
Termvidchakorn,2003) 7
Bảng 4.1. Kích thƣớc các mẫu cá phân tích 37
Biểu đồ 4.1. Tỉ lệ họ Pangasiidae thu đƣợc trên tổng mẫu thu năm 2006 25
Biểu đồ 4.2. Sự phân bố của tổng lƣợng mẫu xuất hiện cá thể họ Pangasiidae 25
Biểu đồ 4.3. Tỉ lệ % mẫu xuất hiện loài phân tích và tổng mẫu Pangasiidae thu
đƣợc 27
Biểu đồ 4.4. Sự phân bố về lƣợng mẫu xuất hiện loài nghiên cứu so với lƣợng mẫu
Pangasiidae 27
Biểu đồ 4.5. Tỉ lệ % số lƣợng cá thể của 3 loài cá phân tích và các loài khác 29
Biểu đồ 4.6. Sự phân bố về số lƣợng các loài nghiên cứu so với tổng lƣợng
Pangasiidae 29
Biểu đồ 4.7. Tỉ lệ % cá thể của từng loài phân tích trong tổng lƣợng cá thể họ
Pangasiidae 31
Biểu đồ 4.8. Sự phân bố về số lƣợng từng loài nghiên cứu so với tổng lƣợng
Pangasiidae 31





1

Chƣơng 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Đồng Bằng Sông Cửu Long nƣớc ta thuộc khu vực hạ lƣu sông Mekong, vốn
có nguồn tài nguyên thủy sản phong phú. Các kết quả nghiên cứu về sự đa dạng và
sự thay đổi thành phần các loài cá sẽ giúp ích cho việc quản lý và phát triển chiến
lƣợc cho nghề nuôi trồng thủy sản tại khu vực này.
Phƣơng pháp định danh trong phân loại học đóng vai trò quan trọng vào việc
xác định sự đa dạng các loài cá trong tự nhiên. Theo truyền thống, phƣơng pháp
định danh dựa trên các đặc điểm hình thái là phƣơng pháp đã đƣợc phát triển lâu đời
và có độ tin cậy. Tuy nhiên, trong một số trƣờng hợp có thể khó phân biệt đƣợc sự
khác nhau giữa những loài có quan hệ gần, do có sự giới hạn về một số đặc trƣng về
hình thái học, đặc biệt khi mẫu vật là cá bột, hơn nữa công tác bảo quản mẫu cá
cũng có thể làm thay đổi màu sắc tự nhiên của cá dẫn đến khó khăn khi phân loại
một số lƣợng lớn mẫu trong thời gian dài.
Gần đây, cùng với sự phát triển và hiểu biết về sinh học phân tử, nhiều chỉ
thị sinh học phân tử đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng nhƣ là một công cụ hỗ trợ đắc
lực cho công tác định danh các loài cá. Định danh các loài cá dựa vào vật liệu di
truyền cho độ chính xác cao. Tuy nhiên, trong trƣờng hợp định danh trên cơ sở phân
tích DNA bộ gen thƣờng gặp một số khó khăn do bộ gen có kích thƣớc lớn, một gen
có thể có nhiều bản sao trên nhiều locus, mỗi locus có nhiều allen khác nhau Mặt
khác, cá chịu ảnh hƣởng trực tiếp bởi môi trƣờng, nên có thể mang nhiều biến dị di
truyền trên DNA bộ gen làm cho việc phân tích kết quả lại gặp càng nhiều khó
khăn. Các chỉ thị phân tử dùng trong định danh và nghiên cứu di truyền thƣờng là
những trình tự có tính bảo tồn cao trong cùng một loài và biến dị khác biệt giữa các
loài, vì thế các gen mã hóa ribosomal RNA (rRNA) là một ứng viên tốt dùng định
danh các loài sinh vật. Việt Nam hiện nay chƣa có nghiên cứu công bố về phân loại
cá dựa vào bộ gen. Trong nghiên cứu này chúng tôi bƣớc đầu “Ứng dụng khóa




2

phân loại hình thái và vùng 16S rRNA trên DNA ty thể trong định danh cá bột
thuộc họ Pangasiidae”. Nhằm hỗ trợ định danh một số loài cá có giá trị kinh tế quan
trọng thuộc họ Pangasiidae trong khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long.
1.2. Mục tiêu đề tài
Ứng dụng một số chỉ tiêu trong hệ thống phân loại hình thái vào phân loại cá bột
thuộc họ Pangasidae để xác định số lƣợng và tỷ lệ các loài Pangasianodon
hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema trong các mẫu thu đƣợc từ tháng
6/2006 đến tháng 9/2006 trên hai nhánh sông Tiền và sông Hậu ở Đồng Bằng
Sông Cửu Long.
Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để kiểm tra đánh giá độ tin cậy của khóa phân
loại hình thái nêu trên.
1.3. Nội dung đề tài
Định danh các mẫu cá thu đƣợc trên hai nhánh sông Tiền và sông Hậu thuộc
Đồng Bằng Sông Cửu Long trong năm 2006 và 64 mẫu cá bột bổ sung thu từ
22/6/2007 đến 30/6/2007.
Giải trình tự 26 cá thể (vùng 16S rRNA mã hóa bởi mtDNA) các loài: P.
hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema thu vào tháng 6/2007.
So sánh trình tự gen trên mtDNA mã hóa vùng 16S rRNA của một số mẫu phân
tích với trình tự có sẵn trên ngân hàng genbank (dữ liệu di truyền) để kiểm tra và
đánh giá phƣơng pháp định danh hình thái truyền thống sử dụng trên cá bột.








3

Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tình hình nghiên cứu định danh các loài cá
2.1.1. Nghiên cứu thế giới
Các loài cá thuộc họ Pangasiidae (cá da trơn) đƣợc nhiều nhà khoa học trên
thế giới quan tâm từ rất lâu do đặc tính cho thịt ngon, dồi dào trong tự nhiên và đặc
biệt có giá trị kinh tế cao.
Hàng loạt các công trình nghiên cứu phân loại cá Pangasiidae ra đời trên
nguyên tắc chung là dựa vào các đặc điểm hình thái bên ngoài. Theo tác giả Roberts
và Vidthayanon (1991), họ cá tra (Pangasiidae) vùng Đông Nam Á gồm hai giống:
giống Helicophagus Bleeker, 1858, giống này có hai loài; giống Pangasius
Valenciennes, 1840 có 19 loài. Sau đó, tác giả Walter J. Rainboth (1996), đã bổ
sung thêm ba giống mới là Laides Jordan, 1919; Pangasianodon Chevey, 1930 và
Pteropagasius Flowe, 1937. Tuy nhiên, việc định danh các loài cá thuộc họ
Pangasiidae đều dựa vào một số các đặc trƣng chung: số tiết cơ, số lƣợng vi, số
lƣợng và hình dạng răng, vị trí sắc tố xuất hiện và hình dạng cơ thể. Ngoài ra, tác
giả Gehrke (1991), cũng công bố dữ liệu về ảnh hƣởng thức ăn tự nhiên lên sự phát
triển của cá bột. Đặc biệt là xây dựng bộ hình mô tả điểm đặc trƣng gần 500 loài cá
trên sông MeKong. Riêng Apichart Termvidchakorn từ năm 1983 đã tiến hành
nghiên cứu về sự phân bố và phát triển của cá Caragid ở sông Kuroshio và các vùng
lân cận Cho đến năm 2003 ông mới xuất bản bộ hình cá bột và cá con thuộc lƣu vực
sông Mekong, với 62 loài khác nhau thuộc 21 họ và 14 bộ.
Việc phân loại dựa vào hình thái để phân biệt các loài cá thuộc họ
Pangasiidae đem lại nhiều dữ liệu có giá trị. Tuy nhiên, công tác định danh cá bột
và cá con dựa vào các chỉ tiêu bên ngoài cho độ chính xác nhất định do cá có kích
thƣớc quá nhỏ và chƣa trƣởng thành. Vì vậy, việc phát triển các chỉ thị di truyền
phân tử (DNA marker) có ý nghĩa rất lớn trong việc hỗ trợ định danh các loài cá bột