v
ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƢỜNG
BÁN RẮN”. Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 10/2/2006 đến ngày 1/6/2006 tại Viện Sinh
Học Nhiệt Đới TP.HCM.
Hội đồng hƣớng dẫn :
PGS-TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG
TS. NGUYỄN NGOC HẢI
CN. ĐỖ THỊ TUYẾN
Chế phẩm enzyme thô dạng bột của hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và
Aspergillus kawasaki đƣợc chiết bằng nƣớc cất, thu đƣợc dịch chiết enzyme thô. Dịch
chiết thô này đƣợc tủa với muối (NH
4
)
2
SO
4
ở các nồng độ (% độ bão hòa) : 50, 55, 60,
65, 70, 75 và cồn 96
0
ở các tỷ lệ dịch chiết enzyme : cồn là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6
Cặn tủa thu đƣợc hòa vào dung dịch đệm và xác định hoạt tính protease nhằm tìm ra
nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa protease. Từ đó khảo sát điều kiện tối ƣu
cho hoạt động của protease từ dịch tủa enzyme thu đƣợc từ nồng độ muối và tỷ lệ cồn
tối ƣu. Cuối cùng, dịch tủa pha trong đệm đƣợc chạy qua sắc ký lọc gel và xác định
trọng lƣợng phân tử protease bằng điện di. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau :
Ở cả hai chủng, nồng độ muối 65% độ bão hòa và tỷ lệ cồn 1 : 4 là tối ƣu để
tủa protease.
Protease của cả hai chủng hoạt động mạnh nhất ở pH = 7 và nhiệt độ 47
0
C.
Hoạt tính protease của Aspergillus oryzae cao hơn hoạt tính của Aspegillus
kawasaki.
MỤC LỤC
NỘI DUNG TRANG
Bìa i
Trang tựa ii
vi
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt khóa luận iv
Mục lục v
Danh sách các chữ viết tắt viii
Danh sách các bảng ix
Danh sách các hình và đồ thị xi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích nghiên cứu 2
1.3 Yêu cầu 2
2.1 Khái quát chung về enzyme 3
2.1.1 Lƣợc sử các công trình nghiên cứu enzyme 3
2.1.2 Định nghĩa về enzyme 5
2.1.3 Phân loại enzyme 6
2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme 7
2.1.4.1 Hoạt tính enzyme 7
2.1.4.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến vận tốc phản ứng enzyme 7
2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống 9
2.1.5.1 Nguồn thu nhận 9
2.1.5.2 Vai trò 11
2.2 Khái quát chung về enzyme protease 11
2.2.1 Định nghĩa enzyme protease 11
2.2.2 Lƣợc sử phát triển các enzyme protease 12
2.2.2.1 Protease từ động vật 12
2.2.2.2 Protease từ thực vật 12
2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật 13
2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease 13
2.2.3.1 Từ động vật 13
2.2.3.2 Từ thực vật 13
2.2.3.3 Từ vi sinh vật 14
2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease 14
2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 15
2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 15
2.3.1.1 Phân loại 15
2.3.1.2 Đặc điểm 15
2.4 Thu nhận enzyme protease từ phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt 16
2.5 Tinh sạch và xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease 18
2.5.1 Trích ly enzyme 19
2.5.2 Quá trình tủa 20
2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp sắc ký 22
2.5.4 Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di SDS –
PAGE 27
PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 29
3.1 Thời gian và địa điểm 29
3.2 Vật liệu 29
3.2.1 Chế phẩm enzyme thô 29
3.2.2 Hóa chất 29
vii
3.2.3 Thiết bị 29
3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm 30
3.3.1 Bố trí thí nghiệm 30
3.3.1.1 Thí nghiệm 1 : Xác định hàm lƣợng và hoạt tính enzyme của dịch chiết enzyme
thô 30
3.3.1.2 Thí nghiệm 2 : Xác định nồng độ muối (NH
4
)
2
SO
4
và tỷ lệ cồn tối ƣu để tủa
enzyme protease 36
3.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Xác định nhiệt độ và pH tối ƣu cho hoạt động của protease 37
3.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel 37
3.3.1.5 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme bằng phƣơng pháp điện
di SDS – PAGE 41
3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 44
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 45
4.1 Hàm lƣợng và hoạt tính của dịch chiết enzyme thô 45
4.2 Nồng độ muối (NH
4
)
2
SO
4
tối ƣu cho việc tủa protease 45
4.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae 46
4.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki 48
4.3 Tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa protease 49
4.3.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae 49
4.3.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki 51
4.4 So sánh việc tủa enzyme trong cồn 96
0
và tủa bằng muối (NH
4
)
2
SO
4
53
4.5 Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme protease 54
4.5.1 pH tối ƣu 54
4.5.1.1 Kết quả đối với chủng Aspergillus oryzae 54
4.5.1.2 Kết quả đối với chủng Aspergillus kawasaki 54
4.5.2 Nhiệt độ tối ƣu 55
4.5.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae 55
4.5.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki 56
4.6 Kết quả tinh sạch qua lọc gel 56
4.6.1 Kết quả đối với Asp.oryzae 57
4.6.2 Kết quả đối với Asp.kawasaki 59
4.7 So sánh hoạt tính riêng protease qua các lần tinh sạch của hai chủng nấm mốc
Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki 62
4.7.1 Tủa protease bằng muối 62
4.7.2 Tủa protease bằng cồn 62
4.8 Kết quả phân tách hệ enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di trên gel SDS –
PAGE 63
PHẦN 5 : KẾT LUẬNVÀ ĐỀ NGHỊ 67
5.1 Kết luận 67
5.1.1 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 67
5.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus kawasaki 67
5.1.3 So sánh hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki 68
5.2 Đề nghị 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO 69
PHỤ LỤC 70
viii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC THUẬT NGỮ
Asp.oryzae : Aspergillus oryzae
Asp.kawasaki : Aspergillus kawasaki
CP : Chế phẩm (Chế phẩm enzyme dạng bột thô do phòng vi sinh
ứng dụng Viện Sinh Học Nhiệt Đới cung cấp).
ix
CBB : Coomasie Brilliant Blue.
ĐVHT : Đơn vị hoạt tính.
HT : Hoạt tính
HTR : Hoạt tính riêng.
TCA : Trichloacetic acid
A.U : Độ hấp thụ.
mS/cm : Milisiemens/cm (đơn vị đo lƣờng độ dẫn điện).
UI : Đơn vị hoạt tính enzyme.
DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG TRANG
Bảng 2.1 Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính của protein 22
Bảng 3.1 Đƣờng chuẩn Albumin 32
x
Bảng 3.2 Đƣờng chuẩn Tyrosine 34
Bảng 3.3 Khối lƣợng (NH
4
)
2
SO
4
tƣơng ứng với mỗi nồng độ 36
Bảng 3.4 Thể tích cồn tƣơng ứng với các tỷ lệ. 36
Bảng 4.1 Hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein của dịch chiết enzyme thô
của hai chủng Asp.oryzae và Asp. kawasaki 45
Bảng 4.2 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch
hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối 46
Bảng 4.3 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối 46
Bảng 4.4 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch
pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối 48
Bảng 4.5 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối 48
Bảng 4.6 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch
hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn 50
Bảng 4.7 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme
thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn 50
Bảng 4.8 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch
pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn 51
Bảng 4.9 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1 g chế phẩm enzyme
thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn 52
Bảng 4.10 So sánh việc tủa enzyme bằng tác nhân cồn và muối ở hai chủng
Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki. 53
Bảng 4.11 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo pH 54
Bảng 4.12 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo pH 55
Bảng 4.13 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo nhiệt độ 55
Bảng 4.14 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo nhiệt độ 56
Bảng 4.15 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus oryzae qua sắc ký lọc gel 59
Bảng 4.16 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus kawasaki qua sắc ký lọc gel 61
Bảng 4.17 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease
bằng muối 62
xi
Bảng 4.18 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease
bằng cồn 62
Bảng 4.19 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử của những protein trong thang. 65
Bảng 4.20 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử protease ở peak 3 của Asp.oryzae 66
Bảng 4.21 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử protease ở peak 2 của Asp.kawasaki 66
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
HÌNH TRANG
Hình 2.1 Đƣờng biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ enzyme đến tốc độ
xii
phản ứng 8
Hình 2.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ
cơ chất 8
Hình 2.3 Công thức cấu tạo enzyme protease 11
Hình 2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi 16
Hình 2.5 Khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus oryzae sau bảy ngày nuôi cấy trên môi
trƣờng CBS – MEA2%. 16
Hình 2.6 Nguyên tắc phân tách trong quá trình tinh sạch bằng sắc ký 23
Hình 2.7 Quá trình lọc gel 26
Hình 3.1 Máy quang phổ UV-Vis 31
Hình 3.2 Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ 38
Hình 4.1 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P-100 khi tủa protease bằng
muối đối với nấm Aspergillus oryzae 58
Hình 4.2 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa protease bằng
cồn đối với nấm Aspergillus oryzae 58
Hình 4.3 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa protease bằng
muối đối với nấm Aspergillus kawasaki 60
Hình 4.4 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-100 khi tủa protease bằng
cồn đối với Aspergillus kawasaki 60
ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1 Đồ thị so sánh hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme protease trong dịch
chiết enzyme thô giữa hai chủng nấm mốc Asp.oryzae và Asp.kawasaki 45
Đồ thị 4.2 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô
của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối 47
Đồ thị 4.3 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô
của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối 49
Đồ thị 4.4 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô
của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn 51
Đồ thị 4.5 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô
của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn 52
xiii
Đồ thị 4.6 Ảnh hƣởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp.oryzae. 54
Đồ thị 4.7 Ảnh hƣởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp.kawasaki 55
Đồ thị 4.8 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.oryzae 55
Đồ thị 4.9 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.kawasaki. 56
Đồ thị 4.10 Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bƣớc tinh sạch khi tủa
protein bằng muối. 62
Đồ thị 4.11 Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bƣớc tinh sạch khi tủa
protease bằng cồn. 63
Đồ thị 4.12 Sự tƣơng quan giữa Lg của trọng lƣợng phân tử và giá trị Rf. 65
1
PHẦN 1 : MỞ ĐẦU
1.2 Đặt vấn đề
Để duy trì sự sống, cơ thể mỗi sinh vật phải thực hiện rất nhiều phản ứng hóa
sinh. Nhƣ vậy điều gì đã giúp các phản ứng này đƣợc tiến hành mau lẹ phi thƣờng mà
vẫn nhịp nhàng cân đối. Đó là nhờ khả năng xúc tác và điều hòa to lớn của enzyme.
Có bản chất là một protein, enzyme không chỉ có thể thực hiện khả năng xúc
tác sinh học bên trong cơ thể mà còn có thể thực hiện các xúc tác bên ngoài cơ thể khi
tạo cho chúng một điều kiện thích hợp để hoạt động. Bởi lẽ đó, trong vòng vài chục
năm gần đây việc sản xuất và ứng dụng các chế phẩm enzyme trên thế giới đã phát
triển với tốc độ rất mạnh mẽ.
Nhân tố quan trọng có tác dụng thúc đẩy cho sự phát triển của nền công nghiệp
sản xuất enzyme đó là khả năng to lớn của vi sinh vật - những nhà máy chế tạo
enzyme. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển cực kỳ nhanh do đó có khả năng tạo ra
một lƣợng enzyme vô cùng lớn trong một thời gian ngắn, đồng thời enzyme do chúng
tạo ra có hoạt lực cao và chúng ta có thể tận dụng các phế thải của ngành khác để làm
môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme.
Protease là một trong những nhóm enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và
phổ biến trong đời sống. Protease đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác
nhau nhƣ công nghiệp, nông nghiệp, y học, trong nghiên cứu khoa học…Hoạt tính của
enzyme nói chung và của protease nói riêng chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố. Điều
kiện tối thích để mỗi loại enzyme hoạt động là khác nhau. Do đó, để sử dụng enzyme
hiệu quả nhất cần khảo sát điều kiện hoạt động tối ƣu cho hoạt động của enzyme đó.
Nhằm mục đích khảo sát hoạt tính protease và tìm hiểu về kĩ thuật sắc ký lọc gel dùng
trong việc tinh sạch enzyme, chúng tôi thực hiện đề tài :“Khảo sát hoạt tính và tinh
sạch enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus
kawasaki trên môi trƣờng bán rắn”.
Aspergillus oryzae từ lâu đã đƣợc dùng nhƣ là nguồn vi sinh vật đƣợc nuôi
cấy để thu nhận enzyme protease. Tuy nhiên, đối với Aspergillus kawasaki thì ngƣời ta
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét